Koç spermasının fiziko-biyokimyasal analizi ve dondurma işleminin sperma üzerine etkisi

Abstract

Bu araştırmada, dondurma işleminin sperma metabolizması üzerine olan etkilerini incelemek amacıyla, 10 adet Merinos ırkı koçtan sun 'i vajen yardımıyla alınan spermaların fiziksel ve biyokimyasal analizleri yapıldı. Fiziksel muayenede spermatolojik özellik olarak hacim, renk, pH ve spermatozoa yoğunluğu kriterleri göz önüne alındı. Araştırmada ortalama olarak hacim 1,62 cm3, renk koyu krem, krem, pH değeri 6,6 ve spermatozoa yoğunluğu 2,53 x 106/mm3 şeklinde belirlendi. Fiziksel muayeneden sonra spermalar, Hettich EBA III santrifüjü kullanılarak 5000 rpm.de 15 dakika santrifüje edilerek seminal plazmaları ayrıldı. Elde edilen seminal plazmalar kontrol grubu olarak nitelendirildi ve biyokimyasal analizler yapıldı. Burada metabolitler grubunu oluşturan fruktoz, kolesterol, trigliserid, üre, total protein ve albumin düzeyleri kinetik spektrofotometre kullanılarak, membran lipidleri bölümünde yer alan fosfatidilkolin ve fosfatidiletanolamin düzeyleri TLC, ekstraksiyon işlemi ve kinetik spektrofotometre kullanımının yer aldığı üç basamakta gerçekleştirildi. Enzimler grubunu oluşturan LDH, ALT, AST, ALP ve ACP düzeyleri otoanalizör kullanılarak, mineraller bölümünde yer alan fosfor, kalsiyum ve magnezyum düzeyleri kinetik spektrofotometre kullanılarak, sodyum ve potasyum düzeyleri ise fleym fotometrik olarak belirlendi. Direkt dondurma grubunda, spermalar herhangi bir işleme tabi tutulmadan -1-direkt olarak, 1/3 sulandırılarak dondurma grubunda İse spermalar tüm sulandırıcıda % 5 oranında gliserol bulunacak şekilde glikoz fosfat sulandırıcısı ile 1/3 oranında sulandırılarak - 196 "C de sıvı azot buharında donduruldular. 20 günlük bekleme süresi sonunda dondurulmuş spermalar 80 °C de 5 sn.de eritilerek kontrol grubunda belirtilen şekilde analize edildiler. Bu analizler sonucunda, elde edilen sonuçların varyans analizlerinde kontrol grubu - direkt dondurma grubu ve kontrol grubu - 1/3 sulandırılarak dondurma grupları arasında olmak üzere fruktoz, kolesterol, üre, total protein, albumin, fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, LDH, ALT, AST, ALP, ACP, kalsiyum, sodyum ve potasyum düzeylerinde p < 0,001 güven eşiğinde istatistiksel önem belirlendi. Trigliserid ve fosfor düzeylerinde kontrol grubu - 1/3 sulandırılarak dondurma grupları arasında p < 0,001, magnezyum düzeylerinde ise p < 0,01 güven eşiğinde önem saptandı. Dondurma gruplarının kendi aralarında ise kolesterol, trigliserid, total protein, albumin, LDH, ALT, ALP, fosfor ve sodyum değerleri bakımından p < 0,001 güven eşiğinde istatistiksel önem bulundu.In this research, physical and biochemical analysis of 10 Merino Rams' sperms obtained by means of artificial vagina were done to examine the effect of freezing procedure on the sperm metabolism. In the physical examination, volume, color, pH and spermatozoa density were taken into account as spermatological features. In research, the average values of volume, color, pH and spermatozoa density were 1,62 cm3, dark cream, cream, 6,6 and 2,53 x 106/mm3 respectively. After physical characterization, sperms were centrifugated at 5000 rpm, 15 minutes to separate their seminal plasma. These seminal plasma were classified as control group. Biochemical analysis were done in seminal plasma. In the group of metabolites, measurements of the levels of fructose, cholesterol, triglyceride, urea, total proteins and albumine were done by using kinetic spectrophotometer. In the group of membrane lipids, measurements of the levels of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine were determined in three stages, thin layer chromatography, extraction procedure and kinetic spectrophotometer. In the group of enzymes, measurements of the levels of LDH, ALT, AST, -3-ALP and ACP were done by using autoanalyzer. In the group of minerals, measurements of the levels of inorganic phosphorous, calcium and magnesium were done by using kinetic spectrophotometer, their of sodium and potassium were done by using flame photometer. In the group of direct freezing, sperms were deep frozen in liquid nitrogen vapor at -196 °C without any procedure. In the group of 1/3 diluted freezing, sperms were diluted with glucose phosphate diluent, containing 5,0 % glycerol in all mixture and were deep frozen in liquid nitrogen vapor at -196 °C. At the end of 20 days conservation period, frozen sperms were melt at 80 °C within 5 second and all the analysis were done as defined in control group. At the end of analysis, the variance analysis of determined results showed that significant differences among control group - the group of direct freezing and the group of 1/3 diluted freezing at the levels of fructose, cholesterol, urea, total proteins, albumine, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, LDH, ALT, AST, ALP, ACP, calcium, sodium and potassium ( p < 0,001 ). At the levels of triglyceride and phosphore, there were significant differences between control group and the group of 1/3 diluted freezing (p < 0,001), and the levels of magnesium were p < 0,01. There were significant differences between the freezing groups at the levels of cholesterol, triglyceride, total proteins, albumine, LDH, ALT, ALP, inorganic phosphorous and sodium (p < 0,001).