Kemoterapik ajan L-asparajinazın Cu(II) iyonları içeren polimerik nanopartiküllere immobilizasyonu ve etkinliğinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, L-asparajinaz (L-ASNaz) enzimi metal şelat afinite tekniği ile poli(2-hidroksietil metakrilat-N-metakriloil-(l)-histidin metil ester-Cu(II)) [PHM-Cu2+] nanopartiküller üzerine immobilize edilmiş ve immobilize L-ASNaz enzimi, yapay serumda L-asparajin (L-Asn) hidrolizi için kullanılmıştır. Enerji dağıtıcı X-Ray analizi (EDX) ile birleştirilmiş taramalı elektron mikroskobu (SEM), Fourier Dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR), geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ve Zeta potansiyel ve boyut analizi ile karakterize edilmiştir. İmmobilizasyon etkinliği değerlendirilmiştir ve immobilizasyon verimi %86.46 ± 3.32, aktivite verimi %73.65 ± 4.78, immobilizasyon etkinliği %85.18 ± 4.36 olarak hesaplanmıştır. Serbest ve immobilize enzimin bağıl aktiviteleri optimum reaksiyon koşulunu belirlemek için karşılaştırılmıştır. L-ASNaz’ın optimum pH’ı 8,5 sıcaklığı ise 45℃ olarak belirlenmiştir. PHM-Cu2+-L-ASNaz’ın optimum pH’ı 7.0 ve sıcaklığı 50℃ olarak belirlenmiştir. Her iki enzimin termal kararlılığı araştırılmış ve immobilize enzimin başlangıç aktivitesinin %60’ını, serbest enzimin ise sadece %34’ünü koruyabildiği belirlenmiştir. Depolama kararlılığı araştırılmış ve immobilize enzim 4 hafta aktivitesinin %80’nini korumuştur. PHM-Cu2+-L-ASNaz’ın 10 kez tekrar kullanımdan sonra başlangıç aktivitesinin %60’ını koruduğu tespit edilmiştir. Ayrıca metal iyonlarının ve organik çözücülerin enzim aktivitesine etkisi araştırılmıştır. PHM-Cu2+-L-ASNaz tripsin hidrolizine karşı aktivitesinin %45’ini korumuştur. L-ASNaz ve PHM-Cu2+-L-ASNaz enzimleri için kinetik hesaplamalar yapılmıştır. Yapay serum ortamında 7 günde L-ASNaz aktivitesinin %38.98’ini korurken, PHM-Cu2+-L-ASNaz %56.87’sini korumuştur. Sonuçlar, L-ASNaz’ın PHM-Cu2+-L-ASNaz nanopartikülleri üzerine immobilizasyonunun substrat afinitesini arttırdığını ve enzim-substrat bileşiklerinin oluşumunu desteklediğini göstermiştir.In this study, L-asparaginase (L-ASNase) enzyme was immobilized on poly(2-hydroxyethyl methacrylate-N-methacryloyl-(l)-histidine methyl ester-Cu(II)) [PHM-Cu2+] nanoparticles and immobilized L-ASNase enzyme was used for hydrolysis of L-asparagine (L-Asn) in artificial serum. Nanoparticles were characterized by scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray (SEM-EDX), Fourier Transform infrared spectroscopy (FTIR), transmission electron microscopy (TEM), Zeta potential and size analysis. The immobilization efficiency was evaluated and the immobilization yield was calculated as 86.46 ± 3.32%, activity yield was 73.65 ± 4.78% and immobilization efficiency was 85.18 ± 4.36%. Relative activities of free and immobilized enzyme were compared to determine the optimum reaction condition. The optimum pH of L-ASNase was determined as 8.5 and temperature as 45℃. The optimum pH of PHM-Cu2+-L-ASNase was determined as 7.0 and the temperature was 50℃. The thermal stability of both enzymes was investigated and the immobilized enzyme retained 60% of its activity while the free enzyme retained only 34%. Storage stability was investigated and the immobilized enzyme retained 80% of its activity after 4 weeks. PHM-Cu2+-L-ASNase retained 60% of its initial activity after 10 times of reuse. The effect of metal ions and organic solvents on enzyme activity was also investigated. PHM-Cu2+-L-ASNase retained 45% of its activity against trypsin hydrolysis. Kinetic calculations were performed for L-ASNase and PHM-Cu2+-L-ASNase. L-ASNase retained 38.98% of its activity after 7 days in artificial, while PHM-Cu2+-L-ASNase retained 56.87%. The results showed that immobilization of L-ASNase on PHM-Cu2+-L-ASNase nanoparticles enhanced substrate affinity and promoted the formation of enzyme-substrate compounds.